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答：可能的原因有：

1、膜沒(méi)有完全均勻濕透,建議 使用100% methanol浸透膜；

2、洗膜不充分，可以增加洗液體積和洗滌次數(shù)；

3、電極不平衡或者加樣位置偏斜，可以調(diào)整電極和加樣；

4、封閉物用量不足，可以提高封閉物濃度，孵育時(shí)保證封閉液完全浸沒(méi)轉(zhuǎn)印膜；

5、封閉物使用不當(dāng)，比如檢測(cè)生物素標(biāo)記的蛋白時(shí)不可用脫脂奶粉封閉；

6、封閉時(shí)間不夠，一般情況下室溫37度封閉1小時(shí)以上或者4度封閉過(guò)夜；

7、抗體非特異性結(jié)合，可以降低抗體濃度，減少孵育時(shí)間；

8、一抗稀釋度不適宜，可以對(duì)抗體進(jìn)行滴度測(cè)試，選擇適宜的抗體稀釋度；

9、一抗孵育的溫度偏高，建議4℃結(jié)合過(guò)夜；

10、抗體濃度過(guò)高或洗滌不夠，建議降低抗體濃度，增加洗滌次數(shù)和時(shí)間；

11、化學(xué)顯色底物過(guò)多，建議按說(shuō)明書(shū)加入適量的顯色底物。

答：可能的原因有：

1、膠濃度不對(duì)，不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差，可以調(diào)整濃度；

2、抗體孵育不充分,建議增加抗體濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間；

3、酶失活，建議直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說(shuō)明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物；

4、目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體，建議查詢(xún)相關(guān)文獻(xiàn)確定；

5、標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建議設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照比對(duì)結(jié)果，增加標(biāo)本上樣量。

答：可能的原因有：

1、目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)，本身可以呈現(xiàn)多條帶，建議查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過(guò)去修飾確定蛋白實(shí)際大小；

2、樣本處理過(guò)程中目的蛋白發(fā)生降解,建議加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時(shí)在冰上操作；

3、雜蛋白多，建議處理目的蛋白；

4、抗體特異性不強(qiáng)，建議使用特異性強(qiáng)的抗體；

5、抗體孵育時(shí)間過(guò)久，建議減少抗體孵育時(shí)間；

6、二抗與抗原有交叉反應(yīng)，建議選擇合適的封閉物；

7、二聚體或多聚體存在，建議增加蛋白質(zhì)變性過(guò)程及強(qiáng)度；

8、底物顯色與曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，建議縮短顯色及曝光的時(shí)間。

答：如果能夠排除下面的幾個(gè)問(wèn)題，那么問(wèn)題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。

1、二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；

2、ECL底物中H2O2不穩(wěn)定，失活；

3、ECL底物沒(méi)覆蓋到相應(yīng)位置；

4、一抗選擇不當(dāng)；

5、二抗失活。